Reaxion. Año 3, Número 2. Enero - Abril, 2016.



Diversidad genética de Tithonia diversifolia (Hemsl) gray de Michoacán:
análisis con marcadores de ADN-SSR. Ver pantalla completa / Imprimir

Por: Ramón del Val Díaz, José M. Miranda Ramírez, Martha Xochitl Flores Estrada, Juan F. Gómez Leyva, Baldomero Solorio Sánchez, Francisco Javier Solorio Sánchez, Salvador González Palomares





Resumen

Con la finalidad de seleccionar las mejores plantas, así como verificar la diversidad genética de Tithonia diversifolia se realizó el análisis de diversidad genética con marcadores moleculares tipo SSR (Simple Sequence Repeats). Se colectaron veinte muestras de plantas de Tithonia diversifolia en cada uno de los sitios de las doce zonas de Michoacán, México y con ello, se conformó el banco de germoplasma y se probaron ocho iniciadores de los cuales se seleccionaron cuatro por su polimorfismo presentado. De un total de 157 bandas que se presentaron, 33 fueron monomórficas y 134 polimórficas, lo que representa un 79% de polimorfismo. Las bandas monomórficas se pueden considerar características de la especie. Se presentaron dos grupos a una similitud de 1.43, uno de ellos conformado por Tepalcatepec 1, 3 y Nueva Italia, el otro grupo conformado por Tepalcatepec 2, Coalcomán 1 y 2, Zitácuaro, Gabriel Zamora, Tacámbaro, Apatzingán y Parácuaro.

Palabras Clave: Marcadores moleculares, análisis genéticos, variación genética.


Abstract

In order to select the best plants and verify genetic diversity of Tithonia diversifolia, was performed analysis of genetic diversity in type SSR molecular markers (Simple Sequence Repeats). 20 plant samples of Tithonia diversifolia in each of the sites of the 12 zones of Michoacan, Mexico were collected and thus the genebank was formed eight initiators of which were tested four times its polymorphism presented. A total of 157 bands that were submitted, 33 were monomorphic and polymorphic 134, which makes 79% of polymorphism. The monomorphic bands can be considered characteristics of the species. Two groups at 1.43 similarity, one made up Tepalcatepec 1, 3 and Nueva Italia, the other group comprised Tepalcatepec 2, Coalcoman 1 and 2, Zitacuaro, Gabriel Zamora, Tacambaro, Apatzingan and Paracuaro were presented.

Keywords: Molecular markers, genetic analysis, genetic variation.


Introducción

Tithonia diversifolia (Hemsl) Gray es conocida comúnmente como tacote, árnica, falso girasol (en México), botón de oro o mirasol (en Colombia), quil amargo (en Guatemala), tara, flor amarilla (en Venezuela) y margaritona o árnica de la tierra (en Cuba). Es una planta perenne que se encuentra frecuentemente en las carreteras a orillas de los caminos (Figura 1), y en muchas zonas es considerada como maleza por su naturaleza invasora y de difícil erradicación1,2,3. Pertenece a la familia Asteraceae, es originaria de Centro América (México y Costa Rica) y actualmente se encuentra ampliamente distribuida en la zona tropical. En México se encuentra principalmente en Campeche, Chiapas, Guerrero, Oaxaca, Quintana Roo, Tabasco, Veracruz, Michoacán y Yucatán4,5,6.

Figura 1. Tithonia diversifolia (Hemsl)

Figura 1. Tithonia diversifolia (Hemsl).

Puede ser utilizada como fuente medicinal para la protección y prevención de ulceras gástricas, se han evaluado extractos en ratas en dosis de 10 a 100 mg/kg de peso y se ha encontrado actividad protectora de úlceras7,8.

Debido a que tiene rápido crecimiento y baja demanda de insumos se ha utilizado como planta multipropósito, como cerca viva, abono verde, fuente de alimento para insectos, ornamental, en silvopastoreo de ganado bovino o forraje de corte en la alimentación de rumiantes, entre otros usos3,4,9,10,11.

Históricamente, los análisis de diversidad o variabilidad genética han estado relacionados con estudios de anatomía comparativa, morfología, embriología y fisiología. Sin embargo, la influencia ambiental y el reducido número de características involucradas en este proceso han limitado el uso de estos marcadores. Actualmente, los avances de la biología molecular han permitido el uso de técnicas para detectar cambios en el genotipo mediante el diagnóstico del ADN12,13,14. También se ha generado un gran número de métodos para identificar y analizar marcadores moleculares entre los que destacan los basados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), que permiten amplificar secuencias específicas o al azar del ADN y requieren de pequeñas cantidades iniciales del mismo. Entre estos marcadores están los denominados polimorfismos del ADN amplificados al azar RAPD (Random Amplified Polymorphic ADN) y los SSR (Simple Sequence Repeats) o microsatélites. Cada secuencia SSR se define por el tipo de unidad repetida (lo más frecuente mono, di, tri o tetra, aunque también penta o hexa nucleótidos) y por el sitio que ocupan en el genoma (locus). Su frecuencia y tipo de repetición varía en los genomas de distintas especies. Por ejemplo, se sabe que son muy abundantes en peces, insectos himenópteros y mamíferos, y menos en los genomas de aves, en plantas y en lepidópteros14,15,16,17,18. Se trata de secuencias altamente variables, entre y dentro de individuos. La variación se manifiesta normalmente como diferencias en longitud entre los distintos alelos del mismo locus. Estas diferencias en longitud surgen de la existencia de un número diferente de repeticiones del motivo básico en cada caso. Se ha estimado que la tasa de mutación en los microsatélites varía entre 10-2 y 10-5 por generación y el mecanismo que explica mejor su alto grado de polimorfismo en tamaño es la acumulación de errores producidos por el deslizamiento de la polimerasa durante la replicación del ADN19.

El objetivo de este trabajo fue caracterizar genéticamente por medio de marcadores moleculares SSR, el germoplasma de Tithonia diversifolia en Michoacán, México.


Método de trabajo

El trabajo de laboratorio de esta investigación se realizó en el Centro de Bachillerato Tecnológico Agropecuario No. 70, Centro de Bachillerato Tecnológico Agropecuario No. 127 “Mariano Azuela” y en el Instituto Tecnológico de Tlajomulco, Jalisco durante los años 2016 y 2017.


Recolección del material vegetal

Se realizó la colecta de material vegetal y semillas en campos de producción de los municipios michoacanos: Apatzingán, Coalcomán, Gabriel Zamora, Nueva Italia, Parácuaro, Tacámbaro, Tepalcatepec y Zitácuaro. Estas muestras se recolectaron a las orillas de las carreteras; solamente las muestras de Tepalcatepec 1, 2 y 3 corresponden al banco de germoplasma de plantas de Tithonia diversifolia de la Fundación Produce Michoacán A.C.


Extracción de ADN

Para el análisis de diversidad genética y extracción de ADN, se tomaron hojas jóvenes de las plantas madres seleccionadas, se lavaron en agua y se guardaron a -40 °C hasta su análisis. Las semillas seleccionadas para el estudio se colectaron de las plantas en estado de madurez fisiológica, y se guardaron en frascos de vidrio en cámara de conservación a 25 °C hasta su utilización. Se pesaron 100 semillas de Tithonia diversifolia en balanza analítica, enseguida en un microscopio estereoscopio se determinó con ayuda de regla milimétrica la longitud de las semillas. El peso promedio de 100 semillas con nueve repeticiones fue de 0.1 g, la longitud fue de 6 mm y un diámetro de 1.5 mm. La extracción de ADN de Tithonia diversifolia, se realizó con el método Doyle y Doyle modificado14 (Orozco-Gutiérrez y colaboradores, 2014). Para la observación y cuantificación de ADN, se realizó en gel de agarosa al 0.8%, en la electroforesis se usó una solución buffer SB, y una corriente eléctrica de 200 volts, y teñido con bromuro de etidio. Una vez obtenido el gel de agarosa al 0.8%, se realizó la cuantificación del ADN de cada una de las variedades. Para cuantificar el ADN de cada una de las variedades de Tithonia diversifolia se realizó una dilución 1:100, y se midió la absorbancia a 260 nm, y para medir la pureza del ADN se usó la medida de la absorbancia a 260 y 280 nm.


Amplificación del ADN por PCR SSR

En el análisis de microsatélites inicialmente se evaluaron ocho iniciadores y con base en el polimorfismo generado se seleccionaron aquellos que presentaron un mayor polimorfismo. Para la amplificación de ADN se utilizó el termociclador marca Techne™. Las condiciones de reacción que se utilizaron fueron las siguientes: en un volumen final de 25 μl se mezcló una solución amortiguadora al 1X, 2 mM de MgCl2, 200 μM de dNTP´s, 0.5 μM de cada iniciador, 2.5 unidades de Taq polimerasa, 2 μl de ADN (50 ng) y 12.5 μl de agua estéril. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: a) la Tm fue de 56 °C; b) 30 ciclos de 1 min a 94 °C; 1 min a 56 °C y 1 min a 72 °C; con una extensión final de 5 min a 72 °C.


Análisis del polimorfismo producto de PCR

Para observar el polimorfismo se realizó la separación de los fragmentos productos de la PCR por electroforesis en gel de agarosa al 1,2% y buffer de corrida SB y tinción con bromuro de etidio, para determinar el tamaño de los fragmentos se utilizó un marcador de 50 pb. Las bandas fueron cuantificadas y se obtuvieron las matrices de presencia, ausencia de bandas, indicando con un 1 la presencia de banda y 0 para la ausencia de la banda en el gel, la matriz fue capturada en el programa Excel versión 2013 y el análisis se realizó por el método de agrupamiento de medias aritméticas (UPMGA) con el programa NTSYSpc versión 2.02j14 (Orozco-Gutiérrez y colaboradores, 2014). Para la selección de bandas polimórficas se consideró aquel en el cual la frecuencia del alelo más común fue <95%. Los análisis estadísticos fueron realizados a partir de esta matriz con el uso de los programas Simqual del paquete NTSYS- PC (Numerical Taxonomy System for Personal Computer) y el programa TFPGA (Tools for Population Genetic Analisys).


Resultados

El ADN obtenido en el total de las muestras presentó una pureza mayor al 80% y una concentración mayor a los 50 ng/u. Los resultados permitieron obtener un banco de ADN con once muestras de producto, correspondientes a los municipios de Apatzingán, Coalcomán, Gabriel Zamora, Nueva Italia, Parácuaro, Tacámbaro, Tepalcatepec y Zitácuaro, Michoacán. El banco de ADN de Tithonia diversifolia se estableció en el Laboratorio de Biología Molecular en el Instituto Tecnológico de Tlajomulco, Jalisco.

De un total de 157 bandas que se presentaron, 33 fueron monomórficas y 134 polimórficas, lo que hace un 79% de polimorfismo. Las bandas monomórficas se pueden considerar características de la especie. El tamaño de los fragmentos de ADN, productos de la PCR varió desde los 170 hasta 1450 pb. Por lo anterior, se puede establecer que el número de loci obtenidos en las muestras es adecuado para el análisis de diversidad genética.

El análisis del dendrograma realizado con el coeficiente de Dice, y mediante el método de clasificación de UPGMA14 (Orozco-Gutiérrez y colaboradores, 2014), mostró que no existe una relación significativa entre 10 muestras y solamente en dos resulta similar, como es el caso de las muestras de Coalcomán. Esto puede deberse a que la procedencia de esas plantas es la misma (genoma idéntico obtenido por propagar plantas por partes vegetativas), mientras que en el resto de muestras se formaron diez grupos a un nivel de similitud de 0.7. Por otra parte, a una similitud de 1.43 se formaron dos grandes grupos, uno de ellos conformado por Tepalcatepec 1, 3 y Nueva Italia; el otro grupo conformado por Tepalcatepec 2, Coalcomán 1 y 2, Zitácuaro, Gabriel Zamora, Tacámbaro, Apatzingán y Parácuaro.


Discusión

Respecto a la prueba de Mantel-Hanzel, esta corroboró la veracidad de las pruebas genéticas, ya que se obtuvo un coeficiente de correlación (r) del 80%, lo cual indica que la prueba realizada en este trabajo fue adecuada. Las pruebas moleculares empleadas en este estudio muestran un alto grado de sensibilidad y polimorfismo para la discriminación de las diversas muestras de Tithonia diversifolia, lo que sugiere que la técnica permite conocer la diversidad genética. El fitomejorador de acuerdo al interés seleccionará las poblaciones con mayor divergencia para establecer su programa de mejoramiento18,19. Ya generadas o seleccionadas las variedades, el proceso de certificación de las semillas incluye otros aspectos que no son del alcance del presente trabajo.

Se puede decir que para contribuir al conocimiento de la diversidad genética de Tithonia diversifolia, resultaron eficientes los microsatélites utilizados como marcadores moleculares para seleccionar material vegetal de acuerdo al interés y considerando los fines o usos.

Se observó que únicamente dos muestras provenientes de Coalcomán presentan similitud entre ellas. En el resto de muestras se observan diez grupos, lo que indica la gran diversidad genética que existe entre ellos, esto es importante debido a que entre mayor diversidad genética se tenga, mayor es la capacidad adaptativa de la población de Tithonia diversifolia. El análisis de diversidad genética realizado por18 Jing y colaboradores (2012), en plantas de Tithonia diversifolia producidas en China, mostró altos niveles de diversidad genética en todas las poblaciones. Esto coincide con la presente investigación, en el sentido de la gran diversidad genética de Tithonia diversifolia, y su gran capacidad de adaptación y sobrevivencia3.


Conclusiones

El desarrollo del presente trabajo permitió establecer las condiciones de análisis genético de Tithonia diversifolia para posteriores estudios de registro y certificación de semillas, así como para la selección y mejoramiento genético asistido por marcadores moleculares.

Con esta metodología se identificó que las muestras analizadas, pertenecen a Tithonia diversifolia, con un grado de similitud del 80% (r). Los marcadores moleculares tipo SSR son una herramienta útil para evaluar las poblaciones naturales, bancos de germoplasma y colecciones de Tithonia diversifolia.


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Fecha de recepción Fecha de aceptación Fecha de publicación
30/01/2017 22/03/2017 31/05/2017
Año 4, Número 3. Mayo - Agosto 2017

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