Se evaluaron los hongos entomopatógenos Beauveria bassiana y Paecilomyces=Isaria fumosoroseus, nativos de Salvatierra, Guanajuato, sobre la palomilla del dorso de diamante (Plutella xylostella) en brócoli. Se realizaron bioensayos para determinar la patogenicidad y virulencia de los hongos sobre la plaga. Se establecieron dos experimentos en diferente ciclo de cultivo: otoño-invierno y primavera-verano, con una densidad de población de 45,000 y 58,000 plantas/hectárea para cada ciclo respectivamente. Se estableció un diseño de bloques al azar con cuatro repeticiones. Se determinó que Beauveria bassiana, a una concentración de 1X10¹² conidias por mL^-1 presentó una tasa de mortalidad de larvas del 100 % al quinto día. Se observó melanización y colonización de los insectos inoculados con P. fumosoroseus y B. bassiana respectivamente. En los dos experimentos en campo, los resultados no fueron concluyentes, debido a la baja densidad de población presente de la palomilla dorso de diamante durante los dos ciclos del cultivo.

Palabras clave: hongos entomopatógenos, Plutella Xylostella, control biológico.

This research consisted of evaluating two entomopathogenic fungi native to Salvatierra, Gto., Beauveria bassiana and Paecilomyces=Isaria fumosoroseus on the diamondback moth (Plutella xylostella) in broccoli. Bioassays were carried out to determine the pathogenicity and virulence of the fungi on the pest. Two experiments were established in a different crop cycle: autumn-winter and spring-summer, with a population density of 45,000 and 58,000 plants/hectare for each cycle, respectively. A randomized block design with four repetitions was established. In the bioassays it was determined that Beauveria bassiana, at a concentration of 1X10¹² conidia per mL^-1, presented a larval mortality rate of 100% on the fifth day. Melanization and colonization of the insects inoculated with P. fumosoroseus and B. bassiana, respectively, were observed. In the two field experiments, the results were inconclusive due to the low population density of the diamondback moth present during the two crop cycles.

Keywords: fungi entomopathogenic, Plutella Xylostella, biological control.

El estado de Guanajuato es el principal productor de brócoli y coliflor a nivel nacional: en él se establecen alrededor de 43,500 hectáreas, de las cuales 24 mil 215 hectáreas son de brócoli, con un rendimiento de 16.6 T/ha, la entidad contribuye con el 60.3 % de la producción nacional¹. Estos cultivos revisten una alta importancia social por la gran cantidad de empleos que se generan de forma directa e indirecta durante los procesos de producción, empaque, transporte y comercialización, generando una derrama económica importante por la entrada de divisas provenientes de las exportaciones a Estados Unidos y Canadá.

Sin embargo, la producción de brócoli se ve afectada por la palomilla dorso de diamante (Plutella xylostella), lepidóptero de la familia Plutellidae, considerado la principal plaga de las crucíferas, debido a la distribución continua y global que presenta. Este insecto figura como uno de los problemas fitosanitarios de mayor impacto social, debido a la resistencia que presenta a más de 100 plaguicidas sintéticos, así como a la toxina Bt de Bacillus thuringiensis, aunado al incremento en los costos de producción^2,3.

Es tal la importancia de la palomilla dorso de diamante que, en el 2023, el Gobierno del Estado de Guanajuato, incrementó el presupuesto designado al establecimiento de campañas fitosanitarias y financiamiento de proyectos de investigación, que permitieran disminuir los daños ocasionados por esta plaga⁴.

El uso de hongos entomopatógenos para el control de la palomilla dorso de diamante ha sido estudiado en todo el mundo. En reportes realizados por Soth et al. (2022), indicaron que tres aislados de B. bassiana y tres de B. pseudobassiana resultaron ser candidatos potenciales para el control de la palomilla dorso de diamante (PDD). Los tres aislamientos de B. pseudobassiana también provocaron un 100 % de mortalidad. Este es el primer informe que demuestra que los aislados de B. pseudobassiana de Nueva Zelanda son candidatos adecuados para el control de PDD. La combinación de tres aislados poco virulentos provocó una mayor mortalidad con una velocidad de muerte más rápida que las combinaciones y aislados altamente virulentos. Tres especies combinadas de Beauveria resultaron en antagonismo².

Esta propuesta se desarrolló como una alternativa sustentable para el control de P. xylostella, a través del uso de hongos entomopatógenos nativos, y de esta manera incidir favorablemente en la producción de brócoli en el estado de Guanajuato.

Evaluar el efecto de dos hongos entomopatógenos nativos (Beauveria bassiana Vuill) y Paecilomyces fumosoroseus ([Wize] Brown y Smith) sobre la colonización, melanización, infección y muerte de la palomilla dorso de diamante (Plutella xylostella L.) a través de del establecimiento de bioensayos in vitro y bajo condiciones de cielo abierto, en Salvatierra, Guanajuato.

La palomilla dorso de diamante fue reportada en México en 1960 atacando el cultivo de col en el Valle de Yaqui, Sonora. Sin embargo, fue hasta mediados de los ochenta cuando se convirtió en una plaga clave en crucíferas. Este lepidóptero es capaz de ocasionar pérdidas de hasta el 100 % en un cultivo, ya sea por daño directo o por afectar la calidad del producto con los residuos que deja, evitando su exportación y comercialización⁵. Es un insecto que posee una alta tasa de reproducción y resistencia a diversos grupos químicos de insecticidas, siendo la primera especie de insecto que a nivel mundial se estableció como resistente a las delta endotoxinas contenidas en B. thuringiensis subsp. kurstaki, así como a nuevos productos e ingredientes activos, debido a la resistencia cruzada que presenta¹. Por esta razón es necesario buscar alternativas de control, que mermen las poblaciones de Plutella a niveles que no causen daños económicos a los cultivos y que sean amigables con el medio ambiente. También, que permitan disminuir las aplicaciones excesivas de agroquímicos, los cuales causan alteraciones y contaminación de los ecosistemas, así como afecciones en la salud de humanos y animales.

En investigaciones realizadas en Nueva Zelanda, reportaron que cepas de Beauveria bassiana y B. pseudobassiana, presentaron una mortalidad del 100 %, en larvas de la palomilla dorso de diamante, tres días posteriores a su inoculación². De igual manera, Shehzad et al. (2021), evaluaron el desempeño de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae sobre larvas de segundo y tercer estadio de P. xylostella mediante dos métodos de inoculación: inmersión de hojas y aspersión directa en condiciones de laboratorio. Cada hongo logró una tasa de mortalidad significativa con las metodologías adoptadas. Sin embargo, se descubrió que B. bassiana fue más eficaz en ambas condiciones, mientras que M. anisopliae, alcanzó porcentajes de muerte del 77.8 % y 70 % al sexto día posterior a la inoculación, en los dos métodos⁶.

Por lo tanto, los hongos entomopatógenos (HE) representan una alternativa sustentable en el control de la palomilla dorso de diamante. Además, estos contribuyen a la reducción de aplicaciones excesivas de productos químicos y por ende a mejorar las condiciones de los ecosistemas y la salud.

El uso de microorganismos biocontroladores como B. bassiana y P. fumosoroseus pueden ser incluidos en un programa de manejo integrado de plagas, no solo de brócoli, sino en todas las crucíferas que se cultivan en Guanajuato.

Esta investigación consistió en evaluar dos aislados nativos de B. bassiana y P. fumosoroseus sobre la palomilla dorso de diamante. Los insectos se recolectaron en campos comerciales de Jaral del Progreso, Gto., latitud: 20.3757, longitud: -101.067 20° 22′ 33″ Norte, 101° 4′ 1″ Oeste. Las larvas se reprodujeron en el laboratorio y mantuvieron en jaulas entomológicas de 50X40X5 cm, alimentándose con hojas de brócoli de 50 días y cambiándolas cada dos días, además se adicionó una solución de agua + azúcar estándar al 15 % para asegurar su reproducción. Las larvas se mantuvieron a temperatura ambiente de 26-28 °C, con una humedad relativa (HR) de 70-80 % y a 14:10 horas de luz-oscuridad.

Las pruebas se realizaron en dos etapas: laboratorio y campo. En la primera etapa se evaluó la virulencia y patogenicidad de aislados nativos B. bassiana y P. fumosoroseus, sobre larvas de P. xylostella a través de un diseño completamente al azar con ocho tratamientos y tres repeticiones. En cada caja se colocaron cinco larvas del tercer instar de P. xylostella, las cuales fueron asperjadas con tres diferentes soluciones conidiales de HE (1X10⁶, 1X10⁹ y 1X10¹² conidias mL^-1) hasta haber inoculado 100 larvas por repetición. Los testigos se inocularon con agua estéril. Posteriormente se incubaron a una temperatura de 27 ± 1 °C durante 10 días. Se observó el comportamiento de los insectos y la aparición de signos de la enfermedad, 24 horas posteriores a la inoculación. Se registró el tiempo y porcentaje de muerte, la eficacia de las dosis y el periodo de residualidad post-mortem de las larvas. La mortalidad se cuantificó diariamente por un período de diez días. Las muertes posteriores a los diez días solo se tomaron como referencia, para determinar la residualidad del producto. Los HE fueron obtenidos en un estudio previo.

Etapa de campo. Se realizó en dos experimentos, el primero se estableció en el campo agrícola del Instituto Tecnológico Superior de Salvatierra ubicado el municipio de Salvatierra, Guanajuato, al sureste del estado, en las coordenadas 20°11’48.39’’ y 100°54’28.77’’. Este estudio se desarrolló durante los meses de junio-octubre del año 2022. El segundo experimento se hizo en la comunidad Puerta del Monte, perteneciente al municipio de Salvatierra Guanajuato, ubicado en las Coordenadas: 20°12′54″N y 100°52′41”, durante los meses de febrero-mayo de 2023. Se estableció un diseño en bloques completos al azar con tres tratamientos y tres repeticiones, y un testigo absoluto.

Reproducción del inóculo. Los hongos fueron crecidos en cajas Petri con medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) conteniendo 50 g de ortópteros molidos y 50 mg de estreptomicina/L. El micelio fue raspado a los 10 días posteriores a la siembra y colocado en un matraz con agua destilada estéril, ajustada a la concentración de 1X10¹² conidias mL^-1.

Análisis de los datos. Se evaluó la mortandad, el tiempo de respuesta y la persistencia de los HE. Se registró diariamente la temperatura, HR y horas luz-oscuridad. Los datos de los bioensayos fueron corregidos con la fórmula de Abbott (1925)⁷, y los resultados se sometieron a un análisis probit para obtener la curva de respuesta concentración-mortalidad, utilizando el programa SAS System for Windows ver 9.0 (SAS Institute Inc 2004)⁸, y se realizó un análisis de varianza (ANOVA), posteriormente, se aplicó la prueba de Tukey (α <0,05) para la separación de las medias.

El uso de medios enriquecidos con la adición de insectos (ortópteros), redujo el tiempo de crecimiento y esporulación de los HE. En la Figura 1 se aprecia el crecimiento y esporulación de B. bassiana y P. fumosoroseus en medio normal PDA y en medio enriquecido con insectos a los 12 y 10 días posteriores a la siembra. En el medio PDA, Beauveria comenzó a desarrollarse en colonias aisladas mientras que, para el caso de Paecilomyces, inició su crecimiento al quinto día después de la siembra. Todas las concentraciones presentaron lento crecimiento y baja o nula esporulación. No obstante, en el medio enriquecido, los dos entomopatógenos iniciaron su crecimiento al tercer día y la esporulación al séptimo día después de la siembra (dds).

Figura 1. Crecimiento y esporulación de B. bassiana y P. fumosoroseus. Los incisos a), b), d) y e) corresponden al medio PDA (12 dds); anverso y reverso de placa. Los incisos d) y f), al medio enriquecido con ortópteros (10 dds). Fuente: elaboración propia.

Tiempos letales de respuesta de las larvas a los entomopatógenos. Los tiempos de muerte presentaron diferencias a una P>α= 0.01 entre dosis y las diferentes concentraciones conidiales de los dos HE. En la Figura 2, se muestran las muertes de larvas registradas a las 240 horas (diez días), posteriores a la inoculación (pi). Las tres concentraciones de B. bassiana, 1X10¹², 1X10⁹ y 1X10⁶ conidios por mL^-1, registraron una mortandad total de larvas a los 5, 8 y 14 días pi, respectivamente. Mientras que, para las mismas concentraciones, en un lapso de 10 días, los tratamientos con P. fumosoroseus registraron 54, 48 y 26 individuos muertos. Sin embargo, no se registraron muertes posteriores a los 10 días. Los testigos para cada uno de los HE mostraron solo 2 y 3 larvas muertas, durante el mismo periodo de tiempo.

Figura 2. Tiempos letales de larvas de P. xylostella de los tratamientos con B. bassiana y P. fumosoroseus. Fuente: elaboración propia.

Para el caso de B. bassiana, el micelio del hongo inició su crecimiento sobre el insecto al séptimo día posterior a la inoculación (pi); para el décimo día estaba totalmente colonizada la larva. Aun cuando se esperaba una respuesta similar de P. fumosoroseus, este aislado mostró una menor agresividad sobre P. xylostella. El efecto del hongo se presentó al séptimo día, sin colonización externa del insecto, pero sí un cambio de coloración en la cutícula de las larvas (melanización), que se tornó de un color verde a café claro y con el paso de los días a un tono café oscuro intenso, casi negro (Figura 3).

Figura 3. a) Melanización de larvas inoculadas con P. fumosoroseus, y b) colonización externa de P. xylostella con Beauveria bassiana. Fuente: elaboración propia.

Con respecto al porcentaje de mortandad, larvas inoculadas con B. bassiana a concentraciones de 1X10¹², 1X10⁹ y 1X10⁶ registraron muertes del 100, 95 y 61 % al quinto, sexto y séptimo día respectivamente. Sin embargo, en la concentración conidial más baja, los insectos que quedaron, no murieron hasta después del 11° día, lo cual, indiciaría que su muerte se debió a una acción retardada del hongo o a la persistencia del hongo sobre el cuerpo del insecto, influyendo factores internos y externo como nutrición, temperatura, humedad relativa, etcétera. También se observó que la viabilidad de las conidias disminuyó en un 68 % después de 15 días.

Los tratamientos con P. fumosoroseus a concentraciones de 1X10¹², 1X10⁹ y 1X10⁶, alcanzaron porcentajes de mortalidad del 52, 47 y 26 % al séptimo día. No obstante, no se registraron muertes posteriores a ese día propiciadas por el entomopatógeno, ya que este se colocó en cámara húmeda para propiciar el crecimiento del micelio. En la Figura 4 se muestran los porcentajes de muerte a los diez días posteriores a la inoculación de las larvas, sobresaliendo los tratamientos con B. bassiana. Para las concentraciones conidiales de P. fumosoroseus, no se siguieron presentando muertes posteriores a los 10 días después de la inoculación.

Figura 4. Porcentaje de mortalidad de larvas, inoculadas con diferentes concentraciones conidiales de B. bassiana y P. fumosoroseus. Fuente: elaboración propia.

De los dos experimentos realizados en campo se obtuvieron los siguientes resultados: en la última semana del mes de junio se estableció la parcela experimental, sin embargo, a finales de septiembre de 2022 el brócoli estaba formando el florete y se pudieron apreciar algunas posturas de la palomilla dorso de diamante, procediendo a la aplicación de los tratamientos en campo. Sin embargo, las temperaturas por debajo de los 19° C y las granizadas tardías afectaron el ciclo biológico de P. xylostella, presentando una incidencia menor al 0.1 %, por lo que no se lograron resultados concluyentes, esto de acuerdo con los parámetros establecidos para determinar el número representativo de muestras en una población. Durante los muestreos posteriores a las dos aplicaciones realizadas de los HE, se lograron capturar 25 individuos en una hectárea, los cuales no formaron parte de una muestra representativa del experimento. Los datos obtenidos de los muestreos, sobre la baja densidad de población de la palomilla dorso de diamante, se corroboraron con los informes proporcionados por el CESAVEG (Comité Estatal de Sanidad Vegetal de Guanajuato); en dicho documento se mencionaba que las lluvias limitaron la movilidad y migración de adultos de la palomilla dorso de diamante (PDD), de áreas del noroeste y noreste del estado de Guanajuato, hacia la parte sur del estado, por lo tanto, la plaga presentó una incidencia baja, de acuerdo a las colectas en las trampas de captura de Plutella, ubicadas en el municipio de Salvatierra, Gto⁹.

De manera similar, la incidencia de plagas como mosquita blanca (Bemisia tabaci), chinche (Bagrada hilaris), pulgón verde (Myzus persicae), pulgón gris (Brevicoryne brassicae) y gusano soldado (Spodoptera exigua) fue baja, los cuales no alcanzaron los umbrales económicos.

Se cosecharon 480 cabezas de brócoli, con un peso promedio de 380 g por unidad. Aun cuando esto no era una variable a evaluar, se observó que las cabezas florales presentaban tallo bien cerrado, sin deficiencias de boro. De haberse presentado P. xylostella, los rendimientos de cosecha hubiesen disminuido por los daños directos e indirectos.

Las aplicaciones de los entomopatógenos para el segundo experimento ubicado en la comunidad Puerta del Monte, municipio de Salvatierra, Gto., demoraron hasta el mes de abril de 2023, debido a condiciones similares que el ciclo anterior, por la ausencia de P. xyllostella.

El principal reto para el trabajo con hongos entomopatógenos es que se trabaja con organismos vivos. Estos responden en forma diferente a los estímulos del ambiente y de la nutrición proporcionada, teniendo que normalizar y estandarizar los protocolos y metodologías a seguir, tanto para la elaboración de los medios de cultivo, como para su reproducción y evaluación in vitro y campo¹⁰.

En esta investigación, los resultados arrojaron que el medio PDA no contenía los requerimientos nutrimentales para propiciar un desarrollo óptimo del crecimiento y producción de esporas en los dos entomopatógenos; mientras que en el medio enriquecido con ortópteros (chapulines), se aceleró el crecimiento en el medio, logrando observar a simple vista, el micelio de los dos HE al tercer día y la esporulación al séptimo día. Los medios de cultivo, suplementados con polvo de pupas de insectos con Spodoptera frugiperda y Heliothis virescens, inducen el crecimiento de los hongos entomopatógenos de B. bassiana y Metarhizium robertsii. También, se incrementó la patogenicidad de M. robertsii sobre larvas de S. frugiperda¹¹. De acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio, el uso de insectos en la producción de hongos entomopatógenos en laboratorio, es una alternativa viable, que puede ser implementada para asegurar el crecimiento y esporulación del HE y asegurar la patogenicidad y virulencia de las cepas.

Los hongos entomopatógenos presentan diversos mecanismos de acción sobre los insectos. En este estudio se observó melanización y colonización del cuerpo de Plutella. El proceso de infección y colonización de los hongos entomopatógenos sobre los insectos se realiza a través de la cutícula externa. Este proceso infectivo incluye la adhesión de las esporas. B. bassiana, es capaz de producir toxinas como la Beauvericina, que ayuda a romper el sistema inmunológico del patógeno, lo que facilita la invasión del hongo a todos los tejidos. Además, secreta otras toxinas como beauvericin, beauverolides, bassianolide, isarolides, ácido oxálico y los pigmentos tenellina y bassianina, que han mostrado poseer cierta actividad insecticida¹². El propósito de las toxinas es evitar el ataque a las estructuras invasivas del hongo, además de degradar el exoesqueleto de los insectos hospederos y penetrar a través de un tubo germinativo. La invasión y crecimiento del hongo se realiza dentro del cuerpo del insecto, causando la muerte por daño mecánico o por la acción de las toxinas y finalmente ocurre la producción de nuevas esporas y su dispersión¹³.

El uso de aislados nativos para el control de plagas es más efectivo que los microorganismos introducidos. No obstante, no todas las cepas nativas e introducidas presentan la misma eficiencia en el biocontrol de insectos, esto debido a la selectividad que pueden presentar por determinada plaga, a las condiciones edafoclimáticas, a la viabilidad de las esporas en el sustrato y durante el almacenamiento, a la patogenicidad, virulencia y persistencia que pueda presentar el aislado y a los requerimientos nutrimentales del biocontrolador y dieta del hospedante. Las concentraciones conidiales aplicadas también juegan un papel importante en la colonización de insectos, por tal motivo, los resultados obtenidos, arrojaron que, tanto B. bassiana como P. fumosoroseus presentaron diferencias con respecto a los tiempos y porcentajes de muerte bajo condiciones controladas. Los hongos biocontroladores pueden tener un comportamiento diferente, de acuerdo al ambiente en el que se evalúen. Cepas que fueron aisladas con un potencial menor de patogenicidad en pruebas de laboratorio, resultaron ser más eficientes en los experimentos en campo¹⁴.

Es importante reconocer que los HE son una alternativa viable para el control de P. xylostella, insecto con una amplia capacidad para desarrollar resistencia al menos a 95 diferentes ingredientes activos, incluyendo las cipermetrinas, abamectina, indoxacarb, spinosad, permetrina, fipronil y productos elaborados a base de la bacteria Bacillus thuringiensis⁶. No obstante, es recomendable establecer un manejo integrado que involucre diferentes métodos de control, para evitar que esta plaga también llegue a generar resistencia a los entomopatógenos.

Los medios de cultivo enriquecidos con insectos de la clase ortóptera redujeron los tiempos de desarrollo y crecimiento de los hongos entomopatógenos e indujeron a la esporulación de los mismos. Los aislados nativos de Beauveria bassiana y Paecilomyces fumosoroseus a concentraciones de 1X10¹² conidios mL^-1, causaron una mortalidad del 100 y 54 % respectivamente sobre larvas del tercer instar de P. xylostella, al quinto día después de la inoculación. Aun cuando en los bioensayos existieron diferencia entre los tratamientos, es necesario que se replique el experimento en campo, específicamente, en áreas con altas densidades poblacionales de la palomilla dorso de diamante.

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